【前沿大综述】NAD+缺失在年龄相关的血管功能性紊乱中的作用
编者按
NAD+在血管中的作用被越来越多的发现，去年哈佛医学院也发现NMN可逆转血管衰老：这篇综述详细描述了NAD+延缓血管衰老的机制和保护作用。本文由复旦药学院PHD Candidate Freda翻译整理，以下Enjoy：
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摘要
衰老引起内皮的改变导致血管功能性紊乱，并引发一系列衰老相关的病理性的变化。为研究如何改善血管状态，延长老年人的健康跨度和寿命，需要了解细胞和分子水平的血管老龄化机制。体外的组织模型研究表明年龄的增加导致多个组织可以利用的NAD+减少，而补充NAD+前体可以缓解一些年龄相关的细胞损害。本文广泛性的介绍了NAD+相关的信号通路（包括依赖NAD+的沉默调节蛋白和聚(adp-核糖)聚合酶抑制剂）以及血管老龄化过程中血管内皮NAD+缺失可能产生的结果。本文也讨论了逆转老龄化引起的细胞水平NAD+降低的治疗措施产生的多方面的血管保护效应以及潜在的不足。本文也广泛讨论了NAD+中间体的预防和治疗方法，这些治疗方法临床上可以有效干预脑缺血、血管性认知功能障碍和其他涉及血管病理的常见老年性疾病（如肌体老化、体弱）。本文建议NAD+前体（如烟酰胺核糖、烟酰胺单核苷酸、烟酸）可以作为联合疗法的重要组成部分减慢血管老龄化过程，延长心血管的健康跨度。
关键词：老年科学、衰老、氧化应激血管内皮功能障碍、线粒体
血管老化决定寿命和健康跨度
在未来几十年，西方人均年龄将继续增长。平均生命期的显著延长和生育率的降低导致65岁以上老年人口成为社会总人口的重要组成部分（在欧盟的占比从19 %上升到29%（2））。到2070年，欧盟80岁以上老年人口占比将从5%上升到13%，日本和美国也会出现类似的显著变化。伴随老年人口占比的增加（65岁及以上人口与15-64岁人口的比值：2016年为29.6%，2070年为51.2%）而引起的财政紧张：养老金、健康护理和长期医疗护理将成为每个工业社会的重要挑战（64）。
衰老影响身体的生理和病理状态，而衰老引起的心血管系统的改变与寿命和健康跨度的相关性更高。在发达国家，约1/3 65岁死亡的老年人和接近2/3 85岁死亡的老年人是由心脑血管疾病引起的（164），心脑血管疾病已经成为老年人最常见的致死因素（1）。另外，衰老引起的脉管系统的功能性和结构性改变是一系列老年性疾病的发病机制，这些老年性疾病限制了健康跨度，降低员工的工作参与，增加老年人对社会的依赖和加重了养老体系的建设。常见的老年性疾病包括：冠心病、心肌梗塞、血管认知性损害和血管性痴呆（包括中风）、阿尔茨海默症、高血压、外周动脉疾病、少肌症、肾脏和眼相关疾病（164）。衰老引起内皮细胞的凋亡，损害内皮血管的再生能力，促进毛细血管退化（13, 36, 40, 75 45）。毛细血管密度的降低（微血管稀少）导致组织灌注减少，而组织灌注减少是死亡率和发病率增加的重要因素（13,142,149,157,168,169）。血管的病理性变化也引起步态和平衡感的紊乱导致易跌倒（57，145,151,165）。衰老的脉管系统的促炎症因子的变化是老年人慢性炎症疾病的重要发病原因，包括动脉粥样硬化疾病（包括冠心病、中风、外周动脉疾病、肾动脉狭窄）、骨关节炎（6）、代谢疾病和胃肠道疾病。衰老的内皮促进了凝结，损害干细胞的生物学功能（如通过改变血管干细胞龛的局部微环境（81, 129））。衰老引起的微环境和转运功能紊乱（如促进微生物代谢产物渗漏到系统循环中）很可能引起全身慢性低度炎症和远端的器官损害（135）。衰老引起的内皮表型的变化改变了生长因子、细胞因子和酶类的分泌，进而促进肿瘤发展、浸润和癌症转移（173）。微血管气体递质（包括NO）的损害性释放影响骨骼肌、心脏和中枢系统中线粒体的功能和细胞的生物能量代谢（105, 106）。
因此，研究血管老化的机制可以更好地预测和防止血管变化在老年性疾病中致病作用（83），同时进一步的明确大血管和微血管的衰老过程的作用，有助于研究和评价针对日益增长的健康问题的饮食、生活方式和药理学方面的对策。
氧化应激和内皮功能紊乱在血管老化中作用
内皮依赖性NO介导的血管舒张功能损害（血管内皮功能障碍）常用来评价血管健康（29, 35, 60, 120, 132）。心血管疾病相关的内皮功能障碍是动脉粥样硬化性血管疾病的一个早期特征，并显著损害微血管的灌注（149,164,167）。临床和临床前研究表明：衰老是内皮功能障碍的一个重要因素（9, 44, 51），抗衰老干预措施的有效性可以通过恢复内皮NO的介导作用来评估（36, 47, 40, 42, 50, 114, 152）。在许多情况下，年龄或者疾病因素引起的NO信号丢失是氧化应激的一个直接反应，超氧化物易于和NO发生反应产生含有游离自由基的过氧亚硝酸盐，而它没有传递NO信号的能力，并破坏其他分子。过氧化物主要来自线粒体和NADPH氧化酶的活化（36, 37, 44, 136, 143, 151）。血管内皮释放的NO是强力血管扩张剂，可以调节血管阻力和组织灌流，同时具有重要的保护血管、保护心脏、抗炎和抗衰老作用。例如，NO可以调节细胞分化和存活，抑制血小板聚集和炎症细胞粘附到内皮细胞上，促进血管发生，破坏促炎症因子信号通路，并可调节线粒体功能和细胞的能量代谢（149, 164, 167）。内皮功能障碍可以引起老年人的心血管疾病、中风和高血压、血管认知性损害和痴呆、以及一系列病理学变化从勃起障碍到运动耐量受损（164, 167）。一氧化氮合酶Ⅲ型（eNOS）缺失性基因小鼠具有提前发育的血管、代谢、脑和心脏老化表型和早期的死亡（89, 150），而其中的许多症状可以通过外源性给予NO逆转（147），这表明内皮释放的NO在衰老过程中具有重要作用。年龄相关的内皮功能障碍的发生与氧化应激增加有关（5, 44, 53, 140, 164, 167）。临床前和临床研究评价了多种试验方法以减弱氧化应激，干扰氧化应激介导的通路，进而改善动物衰老模型中的内皮功能（40, 61, 87, 88, 92, 110, 114, 143, 148, 152, 164, 166）。研究取得了一些可喜的成果，但年龄相关的增加的氧化应激的上游的分子机制仍不清晰。
老年科学研究的关键目的是清晰衰老的生物学过程，将衰老模型中获得的科学成果转化为相关的干预方法进而改善晚年的健康状况（包括心血管健康）。老年科学的主要观点是基础的衰老过程是所有年龄相关病理变化（包括心血管疾病）的原因。干预衰老过程中基础的细胞和分子过程可以预防一些列年龄相关的疾病和状况，包括内皮功能障碍。现在可以明确的是器官和组织衰老是一个非常复杂的过程，涉及多方面的生物学机制。但在血管老化中，基础的细胞和分子衰老过程在氧化应激水平增加和内皮功能障碍中的具体作用仍有待明确。
NAD+缺失和细胞能量代谢损伤在衰老诱导的内皮功能障碍中的作用
研究表明随着年龄的增加，细胞内NAD+的活力降低（62, 95, 177），这可能是组织和进化远缘生物衰老过程中的一个常见因素。提高NAD+的生物合成可以延长酵母、蠕虫和苍蝇的寿命（7, 8, 12, 102, 103），改善小鼠的一般健康和寿命（100,181），这也证实了上述理论。本文综述了相关文献表明年龄相关的NAD+降低在血管老化中发挥重要作用。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和它的磷酸化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）在细胞代谢、能量生成和存活中具有重要作用（15）。超过400种酶需要NAD+和NADP+，主要是在氧化还原过程中接受或者提供电子。NADP是通过NAD+激酶磷酸化NAD+生成。NAD和NADP在过个氧化还原过程中作为电子转运体，但它们的功能是不同的。NAD+主要参与能量的生成过程中需要电子交换的反应，包括糖、脂肪、蛋白质和乙醇的代谢（如糖酵解、丙酮酸和乳酸转化以及丙酮酸和乙酰CoA相互转化、β-氧化、柠檬酸循环和氧化磷酸化）。NADP主要参与合成代谢途径，包括脂肪、胆固醇和DNA合成，对于抗氧化系统成分的再生也具有重要作用。为了维持这些不同的功能，哺乳类细胞的NAD主要以氧化态形式存在，是异化反应中的氧化剂，而NADP主要以还原态（NADPH）形式存在，在细胞生化反应中作为还原剂提供电子。NAD和NADP在氧化态和还原态形式之间的循环是可逆且易于进行的，NAD（P）H还原另一个分子时，它被氧化为NAD（P）+。这些辅酶在氧化态和还原态形式间连续循环并不被消耗。通过改变氧化还原比或者细胞合成和/或降解中的NAD(H)和NADP（H）可以调节辅酶的活力，进而影响依赖NADH和NADPH的大量酶类。
NAD+是细胞存活、衰老和正常生理功能中至少4种重要酶类的底物。这些酶类包括腺苷二磷酸（ADP）-核糖转移酶和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）活性，催化ADP核糖转移反应。NAD+是沉默信息调控因子2（Sir2）相关酶类（sirtuins）的速率控制底物，sirtuins是促存活途径和线粒体功能的关键调节因子，以来自NAD的ADP-核糖作为受体催化乙酰化蛋白中乙酰基的移除。重要的是NAD+依赖的PARP酶和sirtuins均参与DNA修复途径。ADP核糖基环化酶例如CD38也需要NAD+，它与钙信号和内皮NO介导的血管舒张相关（180）。
在哺乳动物，NAD+可以在胞浆中从色氨酸或者烟酸从头合成，也可以从烟酰胺或者此部分的中间体补救合成（Fig. 1）。从头合成途径的第一步，色氨酸转换成N-甲酰犬尿氨酸通过色氨酸-2,3-双加氧酶（TDO）或者吲哚-2,3-双加氧酶（IDO）。TDO是肝脏合成NAD+所必需的，而IDO主要表达在肝外组织，包括内皮细胞（19），炎症因子可以诱导其上调。N-甲酰犬尿氨酸通过甲酰胺酶转化为犬尿氨酸。犬尿氨酸的一条代谢途径是生成犬尿喹啉酸，另一条途径是生成3-羟基犬尿氨酸和喹啉酸NAD+的前体。
Preis-handler和NAD+补充途径的NAD+的成分是从食物中提取或通过分解NAD+中释放出来。含有吡啶基的三种维生素前体分别是烟酸（NA）、烟酰胺（Nam）和烟酰胺核糖体（NR）（图1）。
▲图1:NAD+生物合成的从头合成和补充途径示意图▲
图中总结了L-色氨酸代谢为NAD+的从头合成和由NAD+前体烟酸(NA)、烟酰胺核苷(NR)和烟酰胺(Nam)合成NAD+的补充途径的主要物质。NAD+的从头合成从L-色氨酸(Trp)开始，色氨酸(Trp)在一系列与喹诺酸(QA)的反应中酶促转化。QA由喹诺酸磷酸核糖转移酶(QPRT)转化为烟酸单核苷酸(NaMN)，再由烟酰胺单核苷酸腺苷酸腺苷转移酶(NMNAT)转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAAD)。NAD合成酶(NAD)是由NAD的酰胺化反应生成NAD+。在补充途径中，以Nam为原料，利用限速酶-烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)合成了烟酰胺单核苷酸(NMN)。以烟酰胺核苷(NR)为原料，NR激酶(NRK)磷酸化合成NMN。NMN被NMNATs转换为NAD+。NAD+补充途径的另一底物NA，由烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRT)转化为烟酸单核苷酸(NaMN)，再由NMNATs转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)，最后由NADS转化为NAD。多种酶分解NAD+产生NAM和adp -核糖基，包括sirtuins和Poly (ADP-ribose)聚合酶-1和-2 (PARP-1/2)。NMN是胞外酶CD73的底物，生成NR. IDO:吲哚胺2,3双加氧酶;KAT:犬尿氨酸转氨酶;KMO:犬尿氨酸3-单氧酶;3-OHKyn: 3-羟基 犬尿氨酸;3-HAA: 3-氢氰酸;3-HAO: 3-羟基蒽酸-3，4-双加氧酶; QPRT: 喹啉磷酸核糖基转移酶。
这些化合物被称为维生素B3或烟酸。以烟酰胺为原料合成NAD+需要两个步骤：首先由烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）将烟酰胺转化为单核苷酸（NMN）（69），然后由烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶（NMNATs）催化NMN和ATP生成NAD+。NMNAT1是一种核酶，NMNAT2位于细胞质和高尔基体中，而NMNAT3位于大多数细胞类型的线粒体中（76）。NAMPT被认为是NAD+生物合成途径中的限速成分（123）。在Preis-handler通路中，NA通过添加核糖-磷酸（由焦磷酸磷酰基转移酶（phosphoribosyl phosphorbosyltransferase, NAPRT）合成NA单核核苷酸（NA monnucleleotide, NaMN）。NMNATs将NaMN转化为NA腺嘌呤二核苷酸（NaAD），在ATP和ammonia参与下NAD合酶催化生成NAD+。在缺乏烟酰胺酶的哺乳动物中，钠似乎主要来自细胞外。外源给药NA已被证明是NAD合成的良好前体，除通过直接抑制甘油三酯合成和减少肝细胞VLDL和LDL颗粒的分泌（74），还能显著提高组织NAD+水平（34,71,90）。值得注意的是，烟酸治疗与内皮功能改善有关（126）。NR和烟酸核苷分别通过烟酰胺核苷激酶1 （NRK1）和NRK2（15,16,121）转化为NMN和烟酸单核苷酸（NaMN）。
尽管从头合成途径的存在，在哺乳动物中，NAD+补充途径也是必不可少的：饮食中缺乏烟酸会导致组织NAD+显著下降（122），小鼠缺乏NAMPT是不行的（124）。即使补充途径完整，饮食中缺乏烟酸也会导致严重的维生素缺乏性皮疹（84），其特征是皮肤病，腹泻，痴呆症，最终导致死亡。1995年进行的个人食物摄入量调查的数据表明，在美国，成年人口的营养来中对烟酸摄入量贡献最大的是肉类、鱼类或家禽的混合菜肴、丰富的全麦面包和强化谷物（70）。鱼类，如金枪鱼（烟酸含量：18.4毫克/100克）、沙丁鱼（3）、鲑鱼（烟酸含量：7.8 mg/100 g）、鸡肉（烟酸含量：13.9mg/100 g）和肝脏（烟酸含量：11 mg/100 g）均含有较丰富的NAD+前体。其中，烟酸的最佳食物来源为酵母（烟酸含量：40.2mg/100 g）（4）。尽管烟酸含量相对于上述食物（牛奶中烟酸含量：0.089 mg/100 g）显著降低，但牛奶和奶制品也含有NAD+前体（60%为烟酰胺，40%为NR）（156）。一些食品中含有特别高浓度的NMN，如日本毛豆、牛油果和花椰菜（100）。
应当指出，与估计的平均需求（EAR）（70）相比，美国成年人的烟酸摄入量很大。例如，成年妇女烟酸的中位摄入量为17-20毫克，这超过了预防皮炎所需的11毫克烟酸当量的估计平均需要量。波士顿营养状况调查报告称： 60岁以上的男性和女性的烟酸摄入量中位数分别为每天21毫克和17毫克/天（70）。从补充剂中摄取烟酸也很重要。超过三分之一的成年人参与的全国健康和营养检查调查（1999-2000年）的报告显示，上个月服用了含有烟酸的多种维生素膳食补充剂（119）。来自波士顿营养状况调查的数据表明，在服用补充剂的老年人中，男性50%的补充烟酸摄入量为20毫克，女性为30毫克(70)。值得注意的是，在没有处方的情况下，可以服用含有高达400毫克烟酸的补充剂。并且，自20世纪70年代以来，烟酸还被用作降脂剂，可以抑制甘油三酯合成，加速肝细胞内apo B降解，降低VLDL和LDL颗粒的分泌。
内皮细胞大量表达代谢NAD+前体所需的酶（Csiszar和Ungvari，未发表观察2018年），表明内皮NAD+水平很可能是对NAD前体的外源性给药或饮食摄入的反应。关于NAD生物合成的更广泛的评论，读者可以参考文献（15, 76）。
在正常衰老过程中，NAD+在多个组织中的浓度下降。虽然内皮细胞比较分散，在一个给定的组织中很难衡量他们的NAD+的直接定位，研究从年轻和老年动物的大脑中分离出的内皮细胞的结果表明： NAD+也位于内皮层（Tarantini, Csiszar和Ungvari, 提交, 2019）。
引起衰老引起的NAD+下降的机制可能有很多（127），可能包括降低烟酰胺磷酸化转移酶（NAMPT：是催化NAD+合成的限速步骤）（178）的表达，通过活化的poly （adp -核糖）聚合酶（PARP-1）提高NAD+的利用率（110），增加NADase CD38的活性和表达（23, 146）（图2）。
▲ 图2：AMPK调节多种代谢途径 ▲
衰老引起的NAD+含量下降的机制可能包括上调NAD+的摄取途径(PARP1激活，CD38)和降低NAD+的生物合成(例如，下调烟酰胺磷酸化转移酶[NAMPT])。PARP-1是一种关键的NAD+消耗酶，与sirtuins竞争NAD+的有效性。衰老过程中，DNA损伤的增加导致核PARP-1活化，降低NAD+利用率。在内皮细胞中，衰老引起的NAD +损耗会降低sirtuins蛋白 (SIRT1 2 6和7在细胞核,SIRT3, 4和5中线粒体和细胞溶质SIRT1和2) 的激活，引起线粒体合成失调，线粒体能量合成受损，线粒体活性氧(mtROS)增加、NOX氧化酶上调，减少eNOS活性和NO的生物利用受损，NFKb驱动的促炎症通路活性增加，促生存和应激恢复通路以及参与血管生成的通路下调。NAD+供应的减少也会改变NADH水平和NADP/NADPH的合成，导致NADH和NADPH依赖的分解代谢和合成代谢途径，以及抗氧化系统(如GSH) NADP(H)依赖的再生受损的等一系列衰老相关的变化。这些变化破坏内皮依赖性血管舒张，促进炎症，减少毛细血管化和组织血流量，损害内皮细胞的转运和屏障功能。微血管内皮功能的多方面受损是造成多器官衰老相关的功能障碍的重要原因。黄色箭头强调了可能的干预目标，以挽救老年内皮细胞NAD+ /SIRT-1轴的功能。这些抗衰老干预措施包括用NAD+前体(NR, NMN)治疗来挽救NAD+水平，利用PARP-1激活对NAD+进行药物抑制，或用sirtuin激活分子(STACS)治疗NAD+。
通过对这些通路的功能研究结果显示，NAMPT基因缺失和/或药物抑制NAMPT（抑制剂FK866）可以降低细胞NAD+水平，并模拟内皮细胞（171）、骨骼肌（131）和神经元细胞（38,139）的老化表型。PARP-1是DNA损伤监测网络的组成要素。在老化的细胞中，氧化/氮化应激增加，引起的DNA损伤，PARP-1被激活。PARP-1裂解NAD+，将生成的ADP-核糖片段转移到目标核蛋白和ADP-核糖聚合物上，此过程中细胞内NAD+池持续消耗。有结果表明，在人类组织（皮肤样本）中，衰老引起DNA损伤增加，这与PARP活性增加和NAD+水平下降有关（95）。值得注意的是，在衰老加速的啮齿动物模型中，基因缺失（11）和/或抑制PARP-1被被证实可以增加组织NAD+水平。PARP-1的抑制作用也被证明可以改善老年啮齿动物的内皮功能（110-112）。最近的两项研究表明，NADase CD38的表达和活性随着年龄的增长而增加，阻断CD38活性足以增加[NAD+]，防止骨骼肌、肝脏和脂肪组织等多种组织的老化（23,146）。内皮细胞表达CD38和CD38介导的NAD+降低与eNOS介导的NO生成的缺失有关（22,125）。
除了衰老这个内在影响因素外，促进血管老化的外在心血管危险因素还会导致细胞NAD+耗竭。因此，有证据表明高脂肪诱导的肥胖（27, 59），高同型半胱氨酸水平（20），糖尿病（133, 134）中细胞NAD+水平下降，这可能会导致内皮功能障碍。
细胞内NAD+的水平可以通过多种方式调节，包括上调酶活性（如NAD+生物合成酶），抑制NAD+消耗（76），补充NAD+前体（26）（如烟酸、烟酰胺单核苷酸（48, 107, 159）和烟酰胺核糖）。虽然过表达催化NAD+合成的酶（NAMPT或者NMNATs）能够有效地增加NAD+的水平（54, 76），但可能不能应用。大量的数据证实NMN和NR的治疗可以显著提高NAD+的水平（177）。尤其，NMN基于其多靶点效应，被认为是有潜力的抗衰老药物。
年老的小鼠摄入NMN或者NR后可以增加组织中的NAD+水平（100, 177, 181）。有试验数据显示，NAD+水平上升后几分钟就能被检测出，这意味着NMN在肠道内被迅速吸收入血，要么有效地在循环中被运输，然后轻松地被细胞转化为NAD+，要么在肝脏中被转化为另一种NAD+前体，然后由循环运输到周围组织，增加细胞中NAD+水平。最近的研究证实了第二种观点，结果显示：NMN和NR的首过效应显著，口服的NMN和NR在肝脏内易代谢为烟酰胺，继而进入血液循环，增加了其他器官的NAD+水平（91）。强有力的数据表明，单次口服NR可使人血液中NAD+水平升高2.7倍，而口服NR可升高小鼠肝脏组织中NAD+的水平，其药物代谢动力学水平优于烟酸和烟酰胺（154）。此外， 100、300和1000毫克的单剂量NR可引起人血中NAD+代谢体的剂量依赖性增加（154）。注意，临床前和临床研究中用于逆转衰老的NAD+前体的剂量显著高于预防人类糙皮病（即使使用异位标度法）所需的烟酸当量（约11毫克）的估计平均需求量（70）。
更多的数据显示，在年老鼠体内，AND+前体治疗，可以恢复细胞内NAD+水平，从多方面发挥抗衰老作用，逆转衰老引起的多个器官的功能障碍，包括眼（100），骨骼肌（62），和脑（73）。即使是短期服用NMN或NR也被证明对多种与年龄相关的病理生理性疾病具有显著的保护作用，改善骨骼肌能量和功能（62），保护神经元干细胞，延长小鼠寿命（181）。NAD+促进剂acipimox是一种烟酸衍生物，用于治疗2型糖尿病患者的高脂血症，也可以改善骨骼肌的线粒体功能（170）。NR对高脂肪饮食引起的代谢异常也有保护作用（27, 155）。
重要的是，使用NAD+促进剂长期治疗老年小鼠，明显改善主动脉内皮功能（Ungvari和Tarantini，未发表的观察，2015）（50），增加脑循环（Ungvari和Tarantini，未发表的观察，2015)。目前的研究旨在确定年老并伴有轻度认知障碍的患者长期摄入NR是否可以改善脑血流量（Clinical trial.gov识别码:NCT03482167）。最近，使用NMN治疗老年鼠，结果显示可以逆转年老引起的毛细血管稀疏，并增加骨骼肌中的血流量（48），这似乎是通过增加内皮细胞的造血功能实现的。另有证据显示：NMN治疗老年鼠，可以恢复老鼠的肝窦内皮细胞的开窗（66）。肝窦内皮细胞开窗可以实现肝细胞与血液的物质交换，包括胰岛素、脂蛋白等，以维持代谢平衡。随着年龄的增加，开窗的频率和直径显著降低，可能是由于与年龄相关的VEGF和NO依赖的信号通路的破坏，促进了细胞骨架肌动蛋白和细胞膜脂筏重构（32,72,108）。NMN通过恢复NO信号通路的功能对肝窦内皮细胞有一定的保护作用。有证据显示：在成年人体内，高烟酸饮食可以提高血管内皮细胞的功能（75）。然而，烟酸作为高剂量他汀类药物的附加治疗药物对已确诊的冠状动脉疾病患者并没有改善内皮功能（116）。与多种NAD+促进剂对老年啮齿动物的保护作用相一致的是，使用PARP-1抑制剂治疗老年啮齿动物也显示出改善内皮功能的作用（110-112），而PARP-1抑制剂可以促进NAD+的作用（25,28）。
线粒体功能障碍和线粒体氧化应激升高在衰老引起的心血管功能障碍（47,136,161）和血管损伤（61,143）中起重要作用。衰老内皮细胞中线粒体氧化应激升高的机制可能是多方面的，包括电子传递链的功能失调。通过电子传递链减少电子流，特别是由于衰老引起的复合物I和复合物III的失调（82）可能促进电子泄漏，有利于增加mtROS的表达。NMN抗衰老的关键机制是通过恢复线粒体功能提高细胞能量，至少部分的激活Sirtuin脱酰基酶（SIRT1-SIRT7；图2）。Sirtuins具有抗衰老（33,102,174）和血管保护作用（36,37,42）。敲除老年脑血管内皮细胞中的SIRT1基因，逆转NMN的抗氧化和对线粒体的保护作用。（Ungvari和Csiszar, 2018，未发表的观察)。有直接的证据显示激活SIRT1是NMN诱导的衰老小鼠内皮血管生成能力恢复和毛细血管化增加的基础（141）。先前的试验证实衰老引起的氧化磷酸化（OXPHOS）降低和/或线粒体氧化应激的增加可能（至少一部分）是由于线粒体编码转录本的特异性缺失（62）。NMN可以以SIRT1依赖的方式恢复老年小鼠线粒体编码的OXPHOS亚单位的表达（62）。NR可以上调小鼠骨骼肌线粒体基因表达，促进合成线粒体（27）。此外，最近的研究表明ADMSD（α-amino-β-carboxymuconate-ε-semialdehyde decarboxylase)（115）的药物抑制（ACMSD可以限制α-amino-β-carboxymuconate-ε-semialdehyde在NAD+从头合成途径中的自环化），也能促进NAD+的从头合成和sirtuin 1的活性，从而增强肾脏和肝脏的线粒体功能（77）。我们假设，通过恢复线粒体编码的OXPHOS亚基的表达来拯救血管线粒体功能有助于NAD促进剂对血管的保护作用。这些观察结果与早期研究的结果一致，研究表明激活SIRT1的有益功能与改善线粒体功能有关（14）。使用SIRT1激活剂STACs，如白藜芦醇和SRT1720，在衰老和加速血管老化模型种被证实具有显著的血管保护作用（30,39,56,101,114,161-163,179），这与NAD +促进剂功能相似，包括在内皮细胞和血管平滑肌细胞中调控线粒体合成（38），减少线粒体氧化应激（160），激活抗氧化防御机制（41）和抑制细胞凋亡（114）。STACs还可以增加老年小鼠脑中的毛细血管密度（109），改善内皮功能和调节血流量（152），防止微血管脆弱化（151），并在非人类灵长类动物模型中发挥类似的血管保护作用（18,96）。未来应该研究NAD+促进剂是否能促进血管健康。除了Sirtuin的作用，因为线粒体ATP的产生和膜电位需要NAD作为一种必要的辅酶，恢复NAD/NADH的最佳比例本身也应该能促进在血管细胞中促进线粒体功能。
-展望-
综上所述，近年来，从基础科学和临床角度研究衰老过程在与年龄相关的慢性疾病（55,79,94,130）（包括心血管疾病）发展中的作用的研究进展迅速（10,46,52,55,85,98,104,117,164）。当研究人员开始将生物老年学的突破性发现应用于预防/逆转与年龄相关的血管病理功能和表型改变的新治疗策略的开发时，扩大了血管衰老研究领域的范围。特别是，NAD+促进剂策略被证明在衰老过程多方面的健康受益，包括潜在的血管保护作用。然而，理解NAD +不足引起的老年性血管病变的细胞和分子机制，阐明增加NAD +策略在治疗衰老引起的血管疾病的确切机制，以及临床前研究转化的问题，仍是研究的巨大挑战，也是许多活跃的研究领域的公开问题。
然而NAD+促进剂介导血管保护功能的下游机制尚不清楚。除了NAD+生物合成途径的作用外，新的研究可能揭示NAD+代谢的新途径，包括利用NAD+的新途径（例如NAD+添加到RNAs中（76）），这有助于NAD+促进剂在老年血管系统中的生物学效应。
虽然NMN和NR的作用在不同的疾病模型中得到了验证，但在大血管和微血管老化中，NMN和NR之间没有进行横向比较。未来针对于提高衰老血管中NAD+水平的药物和营养策略也需要考虑NR和NMN有限的口服生物利用度，以及NAD+代谢的组织特异性（91）。此外，最近的一项Meta分析研究中烟酸与安慰剂相比，无论是单独或与他汀类药物或其他疗法联合治疗，都能降低低密度脂蛋白胆固醇水平，烟酸治疗不影响全因死亡率，也不降低心血管疾病死亡率，不影响非致死性心肌梗死、中风的患病风险，也不影响血管再生（58）。因此，旨在探索烟酸、NMN和NR治疗的不同生物学效应的研究将具有很高的参考价值。
NAD+生物合成的区域化也没有很好的研究。亚细胞结构（如细胞核、胞质和线粒体）参与NAD+合成的不同途径（176）。然而，考虑到单个酶在大多数情况下似乎是可有可无的（24,175），而且示踪剂研究表明，完整的NAD+可以在细胞质和线粒体之间移动（49），目前还不清楚这种空间组织的相关性。也不清楚NAD+中间体如何跨细胞膜转运并在内皮细胞的不同亚细胞结构间共享。利用同位素示踪技术分析NAD合成-分解的新方法（91），可用于研究内皮细胞特异性NAD+代谢。
2009年，Imai和他的同事提出了一个有趣的概念，叫做“NAD世界”，涉及NAD+代谢和SIRT1在哺乳动物衰老和寿命的统筹调节（67）。从那时起，这一概念不断发展，现在NMN认为是参与下丘脑、脂肪组织和骨骼肌三个关键组织之间通讯的信号分子，调节衰老过程和寿命控制（68）。这意味着下丘脑是衰老过程的高阶控制中心，脂肪组织、骨骼肌和下丘脑之间的通讯由循环因子（包括肌动蛋白和脂肪因子）介导，组成一个反馈回路。重要的是，循环中NMN的转运和吸收以及通过循环因子进行的组织间通讯依赖于（微）血管系统的功能。内皮细胞也表达参与NAD+生物合成和降解通路的关键成分（包括PARP-1和CD38）。此外，SIRT-1调节内皮功能的几个方面已被证实，包括血管生成，血管舒张功能。另外，NMN在衰老过程中对内皮细胞的功能和表型有显著影响。因此，将微血管内皮细胞的功能和年龄相关变化纳入模型，并在NAD世界的框架内考虑内皮细胞（代表最大的内分泌器官）在系统调节衰老中的作用，这将是一件很有趣的事情。
将NAD+促进剂应用于临床时，应考虑几个问题，包括此类治疗的副作用。众所周知，L-色氨酸治疗会引起一系列副作用（打嗝、放屁、视力模糊、腹泻、头晕、嗜睡、口干、头痛和胃灼热），包括潜在的严重嗜酸性粒细胞增多症（1990年从市场上召回）。烟酸治疗可引起脸红反应（17）以及胃肠道副作用和肝脏问题，高剂量（如~3 g/d烟酸）可促进糖耐量受损（99,128）。烟酰胺摄入量3克/天（118）和烟酸摄入量1.5克/天（97）可引起不良反应（恶心，呕吐，和肝毒性的迹象）。烟酸衍生物降脂剂acipimox （Olbetam）也会致使10%的患者出现脸红和胃肠道副作用。患有肝病、糖尿病和酒精中毒的人摄入过量烟酸更容易引起不良反应。与其他NAD+促进剂不同，Nam可以抑制SIRT1去乙酰化酶的最终产物，这也可能产生不良反应。值得关注的是，长期服用NMN对小鼠没有明显的毒性（100）。同样， 5-6个月（63）、10个月（181）或12个月（158）的长期NR治疗没有明显的毒副作用。NR的小规模临床试验研究尚未报道会引起人体的不良反应（154）。一项小型的随机的安慰剂对照、交叉临床试验显示，老年人服用NR补充剂（每天2x500毫克，持续2x6周）也没有出现重大副作用（93）。尽管如此，后续的大规模临床试验应仔细监测与NMN和NR治疗相关的不良事件。预计不久将获得关于老年人NMN和NR治疗的药物动力学、剂量和副作用的可靠资料。目前多项NAD+促进剂的临床研究正在进行，包括NMN对女性代谢健康的影响（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03151239）。正在进行的NR临床试验包括研究NR对线粒体合成和线粒体功能的影响（ClinicalTrials.gov标识符:NCT03432871和NCT02835664）。重要的是，许多NAD+前体被认为是维生素，作为膳食补充剂提供给公众。新的研究还应该确定哪些药物策略旨在通过抑制NAD+的降解来提高细胞内NAD+水平，这将是最适合老年人的保护血管的药物。目前有几种PARP抑制剂将会或正在进行肿瘤适应症的临床试验。可能因为PARP抑制剂具有潜在的基因毒性，限制其在非肿瘤性疾病患者中的使用。
最近报道了一项初步研究结果，NR长期治疗（每天2x500毫克，持续6周）显示出对内皮依赖性扩张和动脉硬化的影响（ClinicalTrials.gov标识:NCT02921659）（93）。但NR对内皮功能和血管健康的影响尚不明确。虽然发现NR会引起血压的小幅下降，并在一定程度上降低主动脉硬度，但它并没有改善内皮依赖性、血流介导的肱动脉扩张（93）。然而，这一初步临床试验也严重的局限性，需要有针对性的随访研究，基于双侧统计推断的结果较少，难以证实NR治疗对血管健康的影响。显而易见，除了NAD+促进剂表现出对血管功能正常的健康成年人的作用外，未来的研究还应包括以内皮功能明显受损为特征的心血管和代谢性疾病的老年患者。还需要进一步研究NAD+的定量方法，评估相关组织中整个NAD+代谢组，可用于临床中评估治疗效率（31）。
过去20年的研究拓宽了我们对细胞衰老过程的促发机制和异质性，引起年龄相关的心血管疾病（164）的认识（78）。在血管老化过程中，也有许多关于信号通路之间交互的研究。随着年龄的增长，多种调节和稳态机制失常，这些代偿机制的破坏也显著降低了细胞对其他应激源的抵抗力。由于与年龄有关的生理功能障碍的复杂性，需要寻找多种方法来延缓心血管衰老。血管衰老过程中“抗衰老”的干预措施需要联合治疗。未来的研究应探讨如何将NAD促进剂与参与衰老过程的其他信号通路的选择性抑制剂结合起来（例如，mTOR）并确定这种联合靶向疗法的剂量限制毒性。
最后，研究平滑肌细胞中NAD+的耗竭也是一个很有前景的方向。有证据表明NAD+水平影响血管平滑肌细胞的收缩力和血管壁的结构完整性（65）。例如，血管平滑肌特异性Nampt缺陷小鼠的主动脉NAD+降低了约40%，似乎促进了动脉瘤的发病（172）。确定NAD+促进剂治疗是否可以逆转/防止血管结构和功能的变化，这些变化继发于平滑肌细胞老化引起的表型变化，这项研究也是很有趣的（136, 137, 144, 151, 153, 165）。
总而言之，我们正在进入一个研究血管老化的新时代，它将改变我们预防和治疗与衰老相关的心血管疾病的方式。为此做好准备的制药公司将在未来几年获得巨大的受益。NAD+促进剂治疗策略具有延缓/逆转心血管系统年龄相关生理衰退的潜力，因此，我们预测它们将在未来成为抗衰老治疗方案中一员，治疗和预防与衰老相关的疾病，延长心血管健康期。
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